| 01 寡核苷酸药物的现状 在1998年至2021年间获得批准上市的寡核苷酸药物有13种，见表1[1]。多年来，基于寡核苷酸的治疗方法在临床上取得了快速的进展，可用于多种疾病的治疗，如心血管疾病、神经系统疾病、代谢疾病、癌症等。目正在进行大量涉及寡核苷酸药物治疗的临床试验。 表1. 已获批的寡核苷酸药物的作用机理 和靶向疾病[1] 
02 寡核苷酸药物（RNA治疗）的优势 众所周zhi，RNA药物已经成为各种新的治疗策略的理想候选方案，其相对于传统治疗药物的主要优势如下[1]。 01 可靶向“无药可治”的目标 ✦ 以RNA为基础的药物能够靶向细胞内几乎任何遗传成分，见图1[1]；其中许多成分使用其他技术可能被认为是“无药可治”的，包括小分子和抗体药物。 
图1.RNA疗法可以靶向不同的细胞遗传成分[1] 02 可快速生产 ✦ 一般来说，新型小分子或抗体药物从开发到生产需要数年时间。然而，一旦确定了RNA的化学结构和递送方式，RNA药物就可以被快速设计、合成并用于临床试验。CO VID-19大流行能够被遏制且显著降低感染者疾病严重程度的原因是针对CO VID-19的疫苗开发和生产速度快。 03 具有长效作用 ✦ 虽然天然RNA很容易被天然核酸酶降解，但合成RNA进行各种修饰后，其稳定性将大大提高。此外，当RNA被脂质体等载体包裹时，在系统给药后，RNA能有效避免核酸酶的攻击，从而延长寿命。 04 可进行个性化治疗 ✦ 对RNA化学结构及其递送系统进行个性化设计，即可针对个体特殊疾病开发对应的RNA药物，且速度快、成本低。 05 无遗传毒性风险 ✦ 与DNA药物治疗相比，RNA治疗没有显著的遗传毒性。这是因为DNA分子通过病毒载体被传递到细胞中，这种载体有可能整合到基因组中并导致突变。而使用RNA药物治疗可以避免这种潜在风险。 03 寡核苷酸药物(mRNA疫苗)的商业化 CO VID-19使mRNA 疫苗从一项相对小众的技术迅速成为主流，目全球使用了数亿剂mRNA疫苗。由于mRNA生产具有模块化特性，Moderna、BioNTech和CureVac等公司开发mRNA用于癌症疫苗、蛋白质替代疗法和其他疫苗。这是因为mRNA不同于小分子和蛋白质药物，它可以被定制以编码几乎任何蛋白质，同时保留几乎相同的化学特征。这使得核苷酸修饰、脂质纳米颗粒（LNP）配方和制造等其他关键技术在本质上可以保持不变。自2012年以来，一项临床概念研究表明，mRNA疫苗非常适合快速应对流行疾病，而CO VID-19在全球的肆虐提出了将这些技术商业化的迫切需求[2]。 04 赛默飞Vanquish Flex-ISQ EM结合Chromeleon IPD助力寡核苷酸分析 赛默飞生物兼容的Vanquish Flex超高效液相色谱仪结合单四杆质谱仪ISQ EM，见图2，在离子对反相色谱流动相体系下使15T、20T、25T、30T、35T的寡聚胸腺嘧啶脱氧核苷酸（Oligodeoxythymidines，Oligo (dT)n）实现分离。并通过Chromeleon色谱数据系统配备去卷积权限（Intact Protein Deconvolution，IPD）同时运行色谱方法、采集质谱数据，以及利用IPD功能确定不同长度寡核苷酸片段的分子量。 
图2.Vanquish Flex超高效液相色谱仪-单四杆质谱仪ISQ EM 仪器配置： • 系统底座：Vanquish System Base (VF-S02-A-02) • 泵：Vanquish Dual Pump F（VF-P32-A, 150µl静态混合器，50µl 毛细管混合器） • 自动进样器：Vanquish Dual Split Sampler FT (VF-A40-A, 25µL定量环) • 柱温箱：Column Compartment H (VH-C10-A，主动预加热器) • 检测器：Variable Wavelength Detector C (VC-D40-A，2.5ul流通池) ISQ EM •色谱软件： Chromeleon 7.3.0配备去卷积权限PN:7200.0046 色谱条件： • 色谱柱：C18 column，1.7µm，2.1×50mm • 流动相：A：15mM TEA和400mM HFIP水溶液；B：50%流动相A-50%甲醇 • 流速：0.2 mL·min-1，梯度洗脱见表2 • 进样量： 25ul • 柱 温： 60℃（still air） • UV检测器：260nm，5Hz • 自动进样器温度：4℃ 表2. 梯度洗脱程序 
质谱参数： • Vaporizer temperature：350℃ • Ion transfer tube temperature：350℃ • Source voltage：-2000 V • Sheath gas pressure：75 psi • Aux gas pressure：7.5 psi • Sweep gas pressure：0 psi • Full scan Mass range：600-2000 m/z • Dwell/scan time：0.5 s • Polarity：Negative # 实验结果与讨论 如图3所示，在该色谱条件下五种寡核苷酸可实现良好分离。在m/z 600-2000范围内对15T、20T、25T、30T、35T寡核苷酸的所有电荷态进行质量确认，发现不同长度寡核苷酸的质量准确度良好，质量偏差＜0.2 Da。 
图3. Oligo (dT)n紫外色谱图和总离子流图
利用Chromeleon色谱数据系统的IPD功能解析寡核苷酸分子量，分析参数设置与结果界面如图4所示。连续进样4次，通过IPD去卷积功能确认15T、20T、25T、30T、35T寡核苷酸的相对分子质量，见表3，质量准确度范围为0.00Da-0.47Da，且重复性很好，相对标准偏差（RSD）＜0.006%。 
图4. Chromeleon去卷积功能解析分子量软件界面 （1）进样序列；（2）目标组分列表；（3）去卷积参数设置；（4）和（6）总离子流图；（5）全扫描质谱图；（7）去卷积谱图；（8）源质谱图；（9）去卷积结果组成列表（点击查看大图） 表3. 寡核苷酸去卷积结果 
展望 寡核苷酸的质量控制需要开展大量实验，以进行分子量确认和样品纯度与产率的测定。由于寡核苷酸在260 nm处有很强的吸收，因此可以很容易地通过紫外检测进行定量。然而，分子量确认需要质谱分析；质量控制也需要一个快速和稳健的方法，以确保实现高通量检测。以上均可以通过将赛默飞生物兼容的Vanquish Flex超高效液相色谱仪与单四杆质谱仪ISQ EM结合来实现。ISQ EM是为色谱仪的日常应用和操作而设计的，它完全集成到Chromeleon色谱数据系统中，该系统具有完整蛋白、多肽和寡核苷酸ISQ EM数据去卷积分析能力，具体方法可参照相关应用文献[3-6]。 参考文献： [1] Kim YK. RNA therapy: rich history, various applications ａnd unlimited future prospects. Experimental & Molecular Medicine. 2022, 19, 1-11. [2] Webb, C., et al. Current status ａnd future perspectives on MRNA drug manufacturing. Molecular pharmaceutics. 2022, 19, 1047-1058. [3] AN 000457: High-throughput analysis of oligonucleotides using a single quadrupole mass spectrometer for quality control. [4] AN 72820：Oligonucleotide characterization for quality control ａnd increased productivity by single quadrupole mass spectrometer with extended mass range. [5] AN 22013：基于Chromeleon软件的核酸样品分子量合规质量控制. [6] TN 73670：Quality control of oligonucleotides with a single quadrupole mass. [7] AN 72818: Impurity profiling of the synthetic peptide LL-37 using high-performance liquid chromatography with combined UV ａnd single quadrupole mass spectrometric detection |
