| 2022/09 —— 赛默飞扩展您的科研视野 十年磨一剑，创新yong不停。值此金秋丹桂飘香之际，赛默飞重磅推出了三合一质谱系列的dian峰之作——Thermo Scientific™ Orbitrap Ascend 三合一质谱系统。这是继Orbitrap Eclipse 三合一质谱之后的再一力作，也是近10年来三合一质谱大的革新。 Orbitrap Ascend质谱在提升整体性能和使用简便性的同时，旨在解决生命科学研究中的挑战，在蛋白质组学鉴定、定量蛋白质组学、结构生物学、生物制药分析、以及小分子复杂性样品研究等域具有广泛的应用潜力。本期小编将带大家来一段Orbitrap Ascend质谱应用之旅，以期借助我们的介绍，以小致大，让赛默飞伴行您的科研之路，助力您拓展研究视野。 Orbitrap Ascend 全新升 在质谱域的漫漫长河里，新的技术尝试层出不穷，各式各样的质谱产品也曾丰富着这个市场。截止到目为止，在z ui经典、z ui耐用的质谱主要为四杆、离子阱、基于傅里叶变换的FT和Orbitrap，以及飞行时间质谱，这几类产品及其组合组成了目市场上主要的质谱产品。2013年，基于四杆、离子阱和Orbitrap质量分析器的三合一质谱横空出世，集超高的分辨率、灵敏度、稳定性及各项扩展功能于一体，一经推出即获得了广泛的关注，大地驱动了生命科学等域的认知和应用。 
△图1：Orbitrap Ascend 三合一质谱仪 如离款发布的三合一质谱Fusion的发布已近10年，新型的三合一质谱仪Orbitrap Ascend质谱的革新成为了近10年来，内部结构变化大的一次。 简而言之， Orbitrap Ascend主要的革新在于4个层面： 
（1）采用更温和的离子漏斗技术，减少易碎裂物质的源内裂解水平，提高检测限，减少假阳性； （2）C-Trap 全新增加多离子通道，用于常规离子储存和MS2碎裂，提升灵敏度和扫描速度；后面的多离子通道依然用于CID、 ETD, UVPD, PTCR ａnd MSn HCD ，保持了系统的多功能性； （3）采用全新传输模块，提高高质量端离子传输效率，离子的扫描范围扩大至m/z 16000（选配HMR?+模式）; （4）全新的自动校正离子源，自定义校正的时间和周期，仪器自动进行校正，从而维持系统在佳性能状态； 形成了我们天所看到的Orbitrap Ascend 三合一系统。 
△图2 Orbitrap Ascend三合一质谱内部结构示意图 （点击查看大图） 02 Orbitrap Ascend 应用域的更新 Orbitrap Ascend 核心模块的革新，带来的是功能上的升，以应对蛋白质组学对灵敏度和通量、生物制药、结构生物学及小分子应用中不断出现的挑战，从而扩展研究的深度和范围。 
△图3 Orbitrap Ascend三合一质谱应对 生命科学研究中的挑战（点击查看大图） 2.1 常规蛋白质组学鉴定 …… // 蛋白质组学一直是后基因组学时代重要的研究域，如何提高蛋白质的覆盖度，提升鉴定深度和广度，一直是科学家们研究的方向。Orbitrap Ascend 质谱采用置的IRM 提高了离子传输效率，灵敏度和扫描速度。 我们采用1 ug HeLa, 50 cm 色谱柱上样，30分钟和45分钟分别可以鉴定到6137和6621个蛋白；46992和56175条肽段。蛋白和肽段的鉴定数量在相同时间下增加了15%和34%。有效的提升了分析的通量，降低实验成本。 
△图4 Orbitrap Ascend有效提升蛋白和肽段 鉴定数目（点击查看大图） 2.2 翻译后修饰 …… // 然而，细胞的许多生命过程不仅与蛋白质的相对丰度相关，还受时空分布可逆的翻译后修饰控制。因翻译后修饰的蛋白的丰度往往较低，且并非很稳定，因此对仪器的性能提出了更高的要求。 Wisconsin-Madison学校的Josh Coon 实验室针对蛋白质磷酸化的研究显示，Orbitrap Ascend 质谱可检测到12050条磷酸化肽段，8821个磷酸化位点。相比于一代的产品，有18~25% 的提升。Coon 博士也对Ascend 系统的性能有着很高的评价，通过扩大磷酸化肽段的覆盖度，提升信号通路深度挖掘或药物活性细胞机制的检测能力。 
△图5 Orbitrap Ascend有效提升PTM 磷酸化肽段 和位点数目（点击查看大图） 2.3 定量蛋白质组学—TMT定量 …… // TMT标记定量采用混样一次上机多个样本进行分析，可以大大的提升分析的通量。目已推出了TMTpr 18-plex，一次性可以分析18个样品。相对于常规LFQ 定量来说，TMT定量不单提高了分析的通量，同时具有更少的缺失值，数据记录更为完整。 哈佛大学医学院的Steven Gygi 团队采用4个细胞系，12个高pH馏分分，结合SPS MS³及实时搜索功能，定量了83386条肽段， 8788的蛋白。Gygi 博士表示，500个蛋白鉴定数量的差异，对于65分钟梯度来说非常显著，提升了定量蛋白研究的深度。 
依赖于Ascend 系统更快的扫描速度及灵敏度，以及实时检索，可显著提高低上样量样品肽段和蛋白的鉴定数量（酵母酶解肽段，图7），并进一步提高SPS-MS³的定量准确性。 
△图7 Orbitrap Ascend显著提高TMT定量肽段 数目和通量（点击查看大图） 2.4 结构生物学及生物药分析 …… // Ascend 质谱采用了新型离子传输模块，有效的提高高质量端离子传输效率，离子的质量范围扩展至m/z 16000（选配的HMR?+模式）。在蛋白高结构解析及蛋白质与小分子共价结合分析域中，更高的质量范围可以有效提高蛋白质的检测范围。 采用选配的HMR?+结合多种碎裂方式，针对细菌中分子量约800 kDa的伴侣蛋白家族的蛋白质GroEL进行分析，在m/z 12,000左右可以清晰的表征。 
△图8 细菌中伴侣蛋白家族的蛋白质 GroEL分析（点击查看大图） 在完整蛋白分析中，提升检测的质量范围只能解决一部分问题。如何降低谱图的复杂性，提供更多可供解析的谱图是另一个核心点。当蛋白分子越大，带电荷数就越复杂，很难解析出明确的带电荷数目。另外，由于共流出的存在，往往存在谱图非常复杂，造成可供解析的谱图较少。 选配的质子转移电荷减少技术（PTCR）通过将蛋白质带有的质子转移给全氟 （十四氢菲）离子，从而造成蛋白质本身电荷逐渐减少，形成一系列电荷减少的离子，再通过相邻价态离子间的质荷比间距即可计算出蛋白质的电荷数目。在对细胞因子-Fc 融合蛋白进行分析时，采用PTCR技术与HMR?+ 的组合，简化的谱图将有助于去卷积。在m/z 5900~6050 这2个PTCR谱图中，可以鉴定10 种完整糖型，从而从复杂混合物中解析到更多的蛋白质。 
△图9 PTCR技术去唾液酸化的Cytokine-FC 蛋白分析（点击查看大图） 2.5 全自动校正离子源 …… // 在大队列分析中，需要保持仪器一直处于佳状态，Ascend 系统在易用性上也做了大的改进。可以更智能化的、自动化的来对仪器进行校正。我们只需要设定个校正周期，选择好时间；软件会自动开始运行校正的项目。从而节省出时间，并且一直维持仪器在一个良好的状态。一般推荐每周校正一次即可。 质谱技术大地驱动了生命科学、制药以及食品环境域的长足进步。这次发布的Ascend 系统，无论是在常规蛋白质组学；定量蛋白质组学；PTM 分析；完整蛋白质表征、生物制药分析；还是偏向于小分子的代谢组学、脂质组学、代谢流等域；Orbitrap Ascend质谱都可以提供强大灵活的功能相匹配，提升科学家们研究的深度和广度。 |
